HPLO法测定保健食品蜂胶软胶囊中白杨素和高良姜素的含量
[摘要]目的：探讨保健食品蜂胶软胶囊中白杨素和高良姜素的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合胶为填充剂，以甲醇-0.15%磷酸(64：36)为流动相，检测波长268nm。结果：白杨素在0.0502～0.8032pg呈良好线性，r=0.999，平均回收率为100.7%，RSD值为1.2%；高良姜素在0.0499～0.7992μg呈良好线性，r=0.999，平均回收率为100.9%，RSD值为0.9%。结论：该方法简便、灵敏、准确，可作为保健食品蜂胶软胶囊的质量控制方法。
[关键词]白杨素；高良姜素；蜂胶软胶囊；高效液相色谱(HPLC)
蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂，将其混入其上腭腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物，是蜜蜂科动物中华蜜蜂等修补蜂巢所分泌的黄褐色或黑褐色的粘性物质，可入药。其性平，味苦、辛、微甘，有润肤生肌，消炎止痛的功效，可治疗胃溃疡、口腔溃疡、烧烫伤、皮肤裂痛，防辐射等病症，保健食品蜂胶软胶囊就是以蜂胶为主要原料。
蜂胶的功效成分主要有黄酮类、酸类、脂类等化合物，其中黄酮类化合物有七十多种，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎、降血脂、调节机体免疫功能等功效，特征成分为杨梅苷、芦丁、槲皮素、山柰酚、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素等。原2003版《保健食品技术规范》采用紫外分光光度法测定总黄酮的含量，方法专属性不佳。本实验采用高效液相色谱法，以保健食品中蜂胶软胶囊为样品，测定其中两种黄酮类指标成分白杨素和高良姜素，为更准确控制蜂胶软胶囊功效成分提供有效的方法。
1仪器与试药
Agilent 1260液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，紫外检测器(G1314B)，自动进样器(G1329B)，工作软件：AgilentChemstation中文工作站，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18；AEL200电子分析天平，超声仪(天津恒奥HU10300F)。
白杨素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：11699-200501)，高良姜素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：11701-200501)，流动相所用甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为蒸馏水。蜂胶软胶囊(广州善元堂医药科技有限公司，批号：150502)，蜂胶葛根软胶囊(广州善元堂医药科技有限公司，批号：BBJ50300602)。
2测定方法与条件
2.1色谱条件
高效液相色谱法：Agilent ZORBAX SB-C18 5tma，4.6mm×150mm；流动相：甲醇-0.15%的磷酸(64：36)；检测波长268nm，流速：1.0mL·min-1，柱温：30℃；进样量：10μL。检测波长268nm的色谱条件下，理论塔板数按白杨素峰计算应不低于3000。
2.2对照品溶液制备
精密称取白杨素和高良姜素对照品各10mg，加甲醇使溶解并定容到100mL的容量瓶中，分别制成含白杨素和高良姜素0.1mg·mL-1的对照品储备液；再各取2mL于10mL容量瓶中定容至刻度，即得浓度为0.02mg·mL-1的对照品混合溶液。
2.3供试品溶液制备
取胶囊10粒的内容物混合均匀，精密称取0.2g于100mL容量瓶中，加甲醇70mL，超声提取30分钟，冷却后加甲醇至刻度线，摇匀，过滤，即得供试品容液。
3方法学考察
3.1色谱峰纯度和色谱峰光谱一致性比较
应用DAD检测器对对照品中白杨素和高良姜素进行峰纯度分析，纯度系数分别为0.999，O.998，表明色谱分离度良好；与样品中对应的色谱峰在200～400nm进行光谱比，在268nm波长处有最大吸收，表明样品色谱峰与对照品色谱峰一致。
3.2线性关系考察
分别配置浓度5，10，20，40，80>g·mL-1的混合对照品溶液，进样10μL，按色谱条件测定，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，线性回归方程为：白杨素：y=7075X-2.147，r=0.9999(n=5)；高良姜素y=4313X-3.139，r=0.9999(n=5)；两者分别在0.0502～0.8032～g和0.0499～0.7992μg与峰面积呈良好的线性关系。
3.3精密度实验
取同一份对照品溶液，连续重复进样5针，以白杨素和高良姜素的峰面积，考察仪器的精密度，白杨素RSD(n=5)为0.1%，高良姜素RSD(n=5)为0.1%，表明仪器精密度良好。
3.4重复性实验
取同一批蜂胶软胶囊，平行取样6份，制备供试品溶液。用外标一点法，计算含量，结果白杨素平均含量为0.71%，RSD值为4.1%；高良姜素平均含量为0.81%，RSD值为4.1%。
3.5稳定性试验
取同一份对照品溶液，48小时内，重复进样，白杨素和高良姜素峰面积RSD(n=8)分别为0.58%和1.12%，表明48小时内溶液稳定。
3.6回收率实验
采用加样回收法，精密称取蜂胶软胶囊样品6份，每份分别精密加入白杨素(0.10039mg·mL-1)和高良姜素(0.999mg·mL-1)對照品储备液各10mL，再加甲醇50mL溶解，超声提取30分钟，冷却后加甲醇至刻度线，摇匀，过滤，按样品分析方法操作，分别计算其回收率，白杨素平均回收率100.7 9/6，RSD 1.2%；高良姜素平均100.9%，RSD 0.9%。见表1、表2。
3.7样品测定
取2批样品各两份，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，按色谱条件分别在高效液相色谱仪上进行含量测定，蜂胶软胶囊含白杨素0.87%，高良姜素0.67%；蜂胶葛根软胶囊含白杨素0.72%，高良姜素0.82%。
3.8检测限与定量限
3.8.1定量限 取混合对照品溶液(浓度：白杨素0.1μg·mL-1，高良姜素0.1μg·mL-1)，0.45μm微孔滤膜滤过，进样5μL，信噪比(S/N)=10：1，进样1针，白杨素峰面积为2.93221，响应值为0.5ng。高良姜素峰面积为2.32899，响应值为0.5ng。
3.8.2检测限 精密吸取混合对照品溶液(白杨素0.04μg·mL-1。高良姜素0.04μg·mL-1)，0.45μm微孔滤膜滤过，进样10μL，白杨素与相邻色谱峰能完全分离，分离度大于1.5，响应值为0.2ng，高良姜素与相邻色谱峰能完全分离，分离度大于1.5，响应值为0.3ng。
3.9耐用性试验
按照已确定的色谱条件，柱温在25℃～40℃改变，色谱峰均较理想并能与相邻峰良好分离；流速在0.8～1.2mL·min-1内变化色谱峰均较理想并能与相邻峰良好分离；流动相，甲醇：0.15%磷酸在(60：40)～(69：31)内变化色谱峰均较理想并能与相邻峰良好分离
4结果分析与讨论
原2003版《保健食品技术规范》采用紫外分光光度法测定总黄酮的含量，比色法未经色谱分离，易出现假阳性，方法专属性差。
采用此高效液相色谱法测定保健食品蜂胶软胶囊黄酮类化合物白杨素和高良姜素，二者在本色谱条件下得到分离，分离度大于1.5，峰形对称，无拖尾现象，杂质也无干扰。该法简便，快速，准确，线性关系好，稳定和回收率符合要求，可以作为蜂胶软胶囊功效成分质量控制方法。, 百拇医药(杨晓梅 董丽荣 郭菊玲)
[关键词]白杨素；高良姜素；蜂胶软胶囊；高效液相色谱(HPLC)
蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂，将其混入其上腭腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物，是蜜蜂科动物中华蜜蜂等修补蜂巢所分泌的黄褐色或黑褐色的粘性物质，可入药。其性平，味苦、辛、微甘，有润肤生肌，消炎止痛的功效，可治疗胃溃疡、口腔溃疡、烧烫伤、皮肤裂痛，防辐射等病症，保健食品蜂胶软胶囊就是以蜂胶为主要原料。
蜂胶的功效成分主要有黄酮类、酸类、脂类等化合物，其中黄酮类化合物有七十多种，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎、降血脂、调节机体免疫功能等功效，特征成分为杨梅苷、芦丁、槲皮素、山柰酚、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素等。原2003版《保健食品技术规范》采用紫外分光光度法测定总黄酮的含量，方法专属性不佳。本实验采用高效液相色谱法，以保健食品中蜂胶软胶囊为样品，测定其中两种黄酮类指标成分白杨素和高良姜素，为更准确控制蜂胶软胶囊功效成分提供有效的方法。
1仪器与试药
Agilent 1260液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，紫外检测器(G1314B)，自动进样器(G1329B)，工作软件：AgilentChemstation中文工作站，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18；AEL200电子分析天平，超声仪(天津恒奥HU10300F)。
白杨素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：11699-200501)，高良姜素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：11701-200501)，流动相所用甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为蒸馏水。蜂胶软胶囊(广州善元堂医药科技有限公司，批号：150502)，蜂胶葛根软胶囊(广州善元堂医药科技有限公司，批号：BBJ50300602)。
2测定方法与条件
2.1色谱条件
高效液相色谱法：Agilent ZORBAX SB-C18 5tma，4.6mm×150mm；流动相：甲醇-0.15%的磷酸(64：36)；检测波长268nm，流速：1.0mL·min-1，柱温：30℃；进样量：10μL。检测波长268nm的色谱条件下，理论塔板数按白杨素峰计算应不低于3000。
2.2对照品溶液制备
精密称取白杨素和高良姜素对照品各10mg，加甲醇使溶解并定容到100mL的容量瓶中，分别制成含白杨素和高良姜素0.1mg·mL-1的对照品储备液；再各取2mL于10mL容量瓶中定容至刻度，即得浓度为0.02mg·mL-1的对照品混合溶液。
2.3供试品溶液制备
取胶囊10粒的内容物混合均匀，精密称取0.2g于100mL容量瓶中，加甲醇70mL，超声提取30分钟，冷却后加甲醇至刻度线，摇匀，过滤，即得供试品容液。
3方法学考察
3.1色谱峰纯度和色谱峰光谱一致性比较
应用DAD检测器对对照品中白杨素和高良姜素进行峰纯度分析，纯度系数分别为0.999，O.998，表明色谱分离度良好；与样品中对应的色谱峰在200～400nm进行光谱比，在268nm波长处有最大吸收，表明样品色谱峰与对照品色谱峰一致。
3.2线性关系考察
分别配置浓度5，10，20，40，80>g·mL-1的混合对照品溶液，进样10μL，按色谱条件测定，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，线性回归方程为：白杨素：y=7075X-2.147，r=0.9999(n=5)；高良姜素y=4313X-3.139，r=0.9999(n=5)；两者分别在0.0502～0.8032～g和0.0499～0.7992μg与峰面积呈良好的线性关系。
3.3精密度实验
取同一份对照品溶液，连续重复进样5针，以白杨素和高良姜素的峰面积，考察仪器的精密度，白杨素RSD(n=5)为0.1%，高良姜素RSD(n=5)为0.1%，表明仪器精密度良好。
3.4重复性实验
取同一批蜂胶软胶囊，平行取样6份，制备供试品溶液。用外标一点法，计算含量，结果白杨素平均含量为0.71%，RSD值为4.1%；高良姜素平均含量为0.81%，RSD值为4.1%。
3.5稳定性试验
取同一份对照品溶液，48小时内，重复进样，白杨素和高良姜素峰面积RSD(n=8)分别为0.58%和1.12%，表明48小时内溶液稳定。
3.6回收率实验
采用加样回收法，精密称取蜂胶软胶囊样品6份，每份分别精密加入白杨素(0.10039mg·mL-1)和高良姜素(0.999mg·mL-1)對照品储备液各10mL，再加甲醇50mL溶解，超声提取30分钟，冷却后加甲醇至刻度线，摇匀，过滤，按样品分析方法操作，分别计算其回收率，白杨素平均回收率100.7 9/6，RSD 1.2%；高良姜素平均100.9%，RSD 0.9%。见表1、表2。
3.7样品测定
取2批样品各两份，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，按色谱条件分别在高效液相色谱仪上进行含量测定，蜂胶软胶囊含白杨素0.87%，高良姜素0.67%；蜂胶葛根软胶囊含白杨素0.72%，高良姜素0.82%。
3.8检测限与定量限
3.8.1定量限 取混合对照品溶液(浓度：白杨素0.1μg·mL-1，高良姜素0.1μg·mL-1)，0.45μm微孔滤膜滤过，进样5μL，信噪比(S/N)=10：1，进样1针，白杨素峰面积为2.93221，响应值为0.5ng。高良姜素峰面积为2.32899，响应值为0.5ng。
3.8.2检测限 精密吸取混合对照品溶液(白杨素0.04μg·mL-1。高良姜素0.04μg·mL-1)，0.45μm微孔滤膜滤过，进样10μL，白杨素与相邻色谱峰能完全分离，分离度大于1.5，响应值为0.2ng，高良姜素与相邻色谱峰能完全分离，分离度大于1.5，响应值为0.3ng。
3.9耐用性试验
按照已确定的色谱条件，柱温在25℃～40℃改变，色谱峰均较理想并能与相邻峰良好分离；流速在0.8～1.2mL·min-1内变化色谱峰均较理想并能与相邻峰良好分离；流动相，甲醇：0.15%磷酸在(60：40)～(69：31)内变化色谱峰均较理想并能与相邻峰良好分离
4结果分析与讨论
原2003版《保健食品技术规范》采用紫外分光光度法测定总黄酮的含量，比色法未经色谱分离，易出现假阳性，方法专属性差。
采用此高效液相色谱法测定保健食品蜂胶软胶囊黄酮类化合物白杨素和高良姜素，二者在本色谱条件下得到分离，分离度大于1.5，峰形对称，无拖尾现象，杂质也无干扰。该法简便，快速，准确，线性关系好，稳定和回收率符合要求，可以作为蜂胶软胶囊功效成分质量控制方法。, 百拇医药(杨晓梅 董丽荣 郭菊玲)
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